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WB,IP,IHC,IF,ChIP,F(xiàn)C所用的抗體有什么區(qū)別?

發(fā)布時(shí)間: 2021-11-14  點(diǎn)擊次數(shù): 16268次

生物醫(yī)學(xué)科研工作者的科研基本離不開(kāi)抗體,WBwestern blot,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 免疫組化),IF(immunofluorescence 免疫熒光),ChIP(Chromatin immunoprecipitation),FC(flowcytometry 流式細(xì)胞) 都需要用到抗體,那么這幾種實(shí)驗(yàn)方法中的抗體有什么區(qū)別呢?

 

我們?cè)?/span>CST上面找p53的抗體,得到了如下的頁(yè)面

可以看出p53抗體有很多種,并且每種抗體能做的實(shí)驗(yàn)還都不一樣,那么為什么不同的抗體能做的實(shí)驗(yàn)不一樣呢?這要從抗體是如何制備的開(kāi)始。

1. 如何才能成為一個(gè)優(yōu)秀的抗原?

制備抗體之前最重要的是如何制備抗原。一個(gè)良好即優(yōu)秀的抗原應(yīng)該具備的素質(zhì)是

a. 分子足夠大。 我們知道抗原與抗原之間的區(qū)別是由抗原決定族決定的,抗原決定族又叫做表位(epitope),這些表位通常是由6-8個(gè)氨基酸組成的。而且要5-10kD才有一個(gè)表位,所以一些分子量太小的蛋白質(zhì)或者多肽很難有一個(gè)表位的,也很難作為一個(gè)合格優(yōu)秀的抗原。注意表位有兩種形式,一種是線(xiàn)性表位,即由氨基酸的序列決定的。另外一種是構(gòu)象表位,是由氨基酸的空間結(jié)構(gòu)決定的。兩個(gè)相隔很遠(yuǎn)的氨基酸序列在空間結(jié)構(gòu)上靠在一起可以形成一個(gè)結(jié)構(gòu)表位。

b. 外源性強(qiáng)。我們常常將抗原注射到動(dòng)物內(nèi)體得到抗體,因此抗原必須要與該動(dòng)物體內(nèi)的成分區(qū)別性大,因?yàn)閯?dòng)物對(duì)自身的物質(zhì)形成了免疫耐受,如果抗原與動(dòng)物自身的物質(zhì)非常相似,則很難引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,也很難得到好的抗體。

c. 結(jié)構(gòu)盡量復(fù)雜。有些物質(zhì)即使分子量很大也不能算是一個(gè)合格的抗原,比如明膠分子量特別大,也屬于外源性強(qiáng)的物質(zhì)。但是明膠的氨基酸基本上是直鏈的氨基酸,在體內(nèi)容易被降解,類(lèi)似的淀粉、核酸、多聚賴(lài)氨酸也是一樣,不是一個(gè)合格的抗原。

2. 制備抗體中常用獲得抗原的方式有哪些?

a. 人工合成多肽。很多家族蛋白相似度很高,比如actin家族中 a-actin, b-actin, r-actin三者之間非常相似,基本上只差幾個(gè)氨基酸,而這些差別的氨基酸往往還被包裹在內(nèi)部。因此只有人工合成這些差別的序列多肽,才可能區(qū)分開(kāi)這三種相似的蛋白質(zhì)。制備出來(lái)的抗體大部分是識(shí)別線(xiàn)性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

b. 純化的重組蛋白。重組蛋白比較容易獲得,而且能夠獲得比較高的純度。但是在重組蛋白中我們?yōu)榱思兓尤胍欢螛?biāo)簽(比如GST, His, Flag等),拿這些帶有標(biāo)簽的重組蛋白去免疫動(dòng)物,自然也會(huì)得到對(duì)標(biāo)簽識(shí)別的抗體。我們常常用His作為標(biāo)簽,因?yàn)樗容^小,而且免疫原性比較弱,產(chǎn)生的抗體可以忽略。制備的抗體可以識(shí)別線(xiàn)性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),也可以識(shí)別天然折疊狀態(tài)下的蛋白質(zhì)。

c. 純化的天然蛋白。天然蛋白存在修飾,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,因此是用來(lái)做抗體zui 好的抗原。但是很遺憾天然蛋白很難達(dá)到較高的純度。制備出來(lái)的抗體*是識(shí)別天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì),對(duì)線(xiàn)性結(jié)構(gòu)的也能識(shí)別。

3. WB,IP,IHCIF,ChIP,FC之間對(duì)抗體需求有什么區(qū)別?

在理解上面技術(shù)對(duì)抗體需求的區(qū)別之前我們首先要知道這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)都需要什么樣的抗體。

a. WB. WB的蛋白經(jīng)過(guò)加熱變性之后都變成線(xiàn)性的結(jié)構(gòu)。因此zui 好的抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來(lái)做實(shí)驗(yàn),結(jié)果也非常特異。

b. IP/CHIP. 我們用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì),因此IP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體來(lái)做,也可以用純化的重組蛋白的抗體。最好不要用人工合成多肽制作的抗體,因?yàn)檫@種抗體識(shí)別的位點(diǎn)可能被深深地藏在了蛋白的內(nèi)心深處。CHIP和IP沒(méi)有太大的區(qū)別,wei一的問(wèn)題在于,如果抗體識(shí)別的表位和該蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的部位一致,則會(huì)導(dǎo)致CHIP實(shí)驗(yàn)的失敗。

c. IF/IHC. 免疫熒光和免疫組化中需要進(jìn)行固定一步,固定是為了盡量讓細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固,與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別,但是又不同WB中加熱變性變成了線(xiàn)性的結(jié)構(gòu)。因此在做IF/IHC實(shí)驗(yàn)中,最合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體,也可以是人工合成多肽得到的抗體(多肽是在蛋白質(zhì)的表面)

d. FC. 流式細(xì)胞中分為兩種,一種是活細(xì)胞的流式,這種流失最好采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來(lái)做,另外一種是經(jīng)過(guò)固定之后的流式,和IF/IHC 所用抗體一致。 在做流式細(xì)胞中,我們有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記,間接標(biāo)記不如直接標(biāo)記真實(shí)準(zhǔn)確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標(biāo)記的抗體;如果研究的蛋白沒(méi)有直接標(biāo)記的抗體,那么就采用間接標(biāo)記抗體,需要添加熒光二抗。

 

4. 常見(jiàn)的問(wèn)題

a. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎?

不一定能通用。流式是用直接標(biāo)記還是間接標(biāo)記?如果是直接標(biāo)記的話(huà),那這個(gè)抗體一般不是FITC標(biāo)記或者就是TRITCPE之類(lèi)的。如果恰好你的免疫組化,也是想用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)直接標(biāo)記,那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標(biāo)記的話(huà),或者是間接標(biāo)記的話(huà),就有麻煩,因?yàn)闊晒馑氐臉?biāo)記很可能會(huì)影響二抗和一抗的結(jié)合。

b. 為什么我的抗體做WB非常好,而做不了IF,IHC等其他任何實(shí)驗(yàn)?

首先恭喜你有一個(gè)WB非常好的抗體,畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次,你這個(gè)抗體很可能是通過(guò)人工合成多肽得到的,和上面所述,你用來(lái)做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì)的中心,因此只能識(shí)別WB中線(xiàn)性的部分。

c. 如何選擇免疫組化抗體?

首先,一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體,單克隆抗體特異性強(qiáng),靈敏度低;多克隆抗體靈敏度高,特異性弱。根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,如果非特異多,那么選擇單克隆抗體;如果陽(yáng)性信號(hào)弱,不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來(lái)源的都是多克隆,小鼠來(lái)源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識(shí)別什么種屬的抗原,抗體說(shuō)明書(shū)上面一般注明有,比如小鼠Mus, 大鼠Rat, Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來(lái)源。比如我們?cè)谌说陌┙M織中做p53的免疫組化,一抗我們采用的是小鼠來(lái)源的p53抗體,那么二抗我們一定要選擇 抗小鼠的二抗比如(山羊抗小鼠,兔抗小鼠),這一點(diǎn)非常重要。最后,一般的抗體說(shuō)明書(shū)都會(huì)注明能做什么實(shí)驗(yàn),如果標(biāo)明了不可以做免疫組化,一定不要選擇;反過(guò)來(lái)說(shuō),即使標(biāo)明了可以做免疫組化,也不一定能夠做,商家只會(huì)夸大其效果。

d. WBIF的二抗是一樣的嗎?

很明顯,不是!免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗(yàn)的,是用FITCPE等標(biāo)記的抗體,結(jié)果需要紫外線(xiàn)激發(fā)并用熒光顯微鏡觀(guān)察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標(biāo)記的抗體,需顯色底物(如OPD\TMB等)直接顯色(肉眼)或化學(xué)發(fā)光法顯影(需特殊儀器)。

e. CHIP的抗體是否可以用來(lái)做WB抗體?

不一定,一般來(lái)說(shuō)做CHIP級(jí)別的抗體對(duì)抗體純度特異性方面都要求比較高,基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識(shí)別的是構(gòu)象表位(比如是由兩個(gè)實(shí)際靠在一起但變?yōu)榫€(xiàn)性結(jié)構(gòu)之后相隔很遠(yuǎn)的兩端序列),而不是線(xiàn)性表位,這種CHIP抗體做不了WB。

f. 抗體說(shuō)明書(shū)上面沒(méi)有寫(xiě)該抗體能夠用于某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)怎么辦?

一般而言,抗體研發(fā)出來(lái)之后都要經(jīng)過(guò)WBIP,IF,IHC實(shí)驗(yàn)。檔發(fā)現(xiàn)濃度不夠做IF,IHC時(shí)候,國(guó)外的抗體一般都是寫(xiě)未檢測(cè),國(guó)內(nèi)的抗體一般是不寫(xiě)。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試,往往只會(huì)浪費(fèi)時(shí)間。你想啊,如果抗體能夠做該實(shí)驗(yàn),他們肯定會(huì)寫(xiě)上去啊。

g. ELISA的抗體能否用來(lái)做WB?

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000IF/IHC1:100,而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個(gè)抗體用來(lái)做ELISA的,那么言外之意就是該抗體效價(jià)不高。但不是說(shuō)ELISA的抗體不能用于做WB,抗體說(shuō)明書(shū)提示做ELISA稀釋比例為1:1000,那么你可以試試1:100做做WB


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